ICS 65.020.01 B16 DB35 DB35/T 1559-2016 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1559—2016 柑橘半穿刺线虫检疫鉴定方法 Detection and identification of Tylenchulus semipenetrans Cobb. 2016 - 04 - 06 发布 福建省质量技术监督局 2016 - 07 - 06 实施 发 布 DB35/T 1559-2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由中华人民共和国福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、福建农业职业技术院、福建农林大学。 本标准主要起草人：林星辉、林谷园、章淑玲、高小倩、李敏。 I DB35/T 1559-2016 柑橘半穿刺线虫检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了柑橘半穿刺线虫鉴定依据、仪器用具及药品、现场检疫和抽样、实验室检疫鉴定、 形态鉴定特征、结果判定以及样本和样品保存与处理。 本标准适用于植物根系、土壤及生长介质中柑橘半穿刺线虫的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB SN/T 3 15569 农业植物调运检疫规程 2122－2008 进出境植物及植物产品检疫抽样 鉴定依据 3.1 柑橘半穿刺线虫基本信息 中文名：柑橘半穿刺线虫 学 名：Tylenchulus semipenetrans Cobb,1913 柑橘半穿刺线虫隶属于线虫门Nematoda (Rudolphi,1808) Lankester,1877、侧尾腺纲Secernentea von Linstow,1905、垫刃目Tylenchida Thorne,1949、环总科Criconematoidea Taylor，1936、环科 Criconematoidae（Taylor,1936）Thorn,1949、半穿刺亚科Tylenchulinae Skarbilovich,1947、半穿 刺线虫属Tylenchulus Cobb,1913。 柑橘半穿刺线虫为营定居性寄生，以二龄幼虫作为侵染虫态，主要从寄主的营养根根尖侵入。其传 播途径主要依靠土壤、生长介质土和带根苗木等寄主植物材料的调运。 柑橘半穿刺线虫的其他信息参见附录B。 3.2 方法原理 将现场检疫中采集的植物根系、土壤以及生长介质样本，送实验室经解剖检查、根系染色检查、贝 1 DB35/T 1559-2016 尔曼漏斗法分离获得线虫、制成临时或永久玻片，显微镜下对成熟的雌虫、雄虫、二龄幼虫主要鉴定特 征仔细观察并测量数据，依据本标准描述的柑橘半穿刺线虫形态鉴定特征、测量数据和基本生物学信息， 按系统分类方法，鉴定其生物学种类。 4 仪器、用具及药品 4.1 仪器及用具 体视显微镜、显微镜、倒置显微镜、电子天平、试管、漏斗、漏斗架、橡皮管、止水夹、分离浅盘、 面巾纸、培养皿、剪刀、刀片、烧杯、载玻片、盖玻片、酒精灯、挑针、记号笔、加热板、打孔器等。 4.2 药品 40%甲醛、甘油、石蜡、氯酸钠、酸性品红、95%乙醇、三乙醇胺、蒸馏水等。 5 现场检验和抽样 5.1 现场检验 在田间或温室（大棚）种植地、销售场地对柑橘半穿刺线虫的寄主植物进行检查，查验植物体的生 长状况（长势），叶片是否有黄化褪绿、变小变薄，枝梢变短，开花减少，座果稀疏，花、果、叶脱落， 树势衰退等症状。采集上述可疑的植物根部和根际生长介质，送实验室作线虫分离。 5.2 抽样 当田间或温室（大棚）地栽的植物没有明显症状表现时，可采用对角线、棋盘式、平行跳跃式或拉 链式的随机取样方法，确定取样点；当田间或温室（大棚）地栽的植物表现明显症状时，对发病点的病 株根部及其周围的土壤进行取样。国内省际间调运的植株抽样数量应符合GB 15569的规定；进出境的 植株抽样数量应符合SN/T 2122－2008的规定。 5.3 样品制作及保存 选定取样植株，在树冠滴水线以内，刨除表土、杂草，采集分布于10 cm～45 cm土层的营养根及根 系土壤。每株5点取样混合为一个样本，每株至少采集500 g的根与根际土壤。将样本装入自封袋中，扎 紧保持湿润，并附上标签，记录寄主、地点、症状特点及采集时间。在实验室对样本进行线虫分离与观 2 DB35/T 1559-2016 察。未及时分离的样本，应放置在4 ℃冰箱保存，保存时间不宜超过1个月。 6 实验室检疫鉴定 6.1 线虫分离 6.1.1 解剖检查 选择植株营养根，清除表面土壤，将根剪成 2 cm～3 cm 长的小段，置于装有适量水的培养皿中， 在显微镜下用解剖针撕开可疑的营养根，挑取其中的线虫，按附录 E 的规定制成临时玻片，用显微镜 检查与鉴定。 6.1.2 染色检查 采用次氯酸钠-酸性品红染色法对根组织柑橘半穿刺线虫染色检查。按附录F进行染色，冷却后以酸 性甘油为浮载剂于显微镜下进行镜检。 6.1.3 贝尔曼漏斗法分离 根际土壤中的柑橘半穿刺线虫各虫态分离采用改良贝尔曼漏斗法。用一小段皮管接于漏斗颈上， 用止水夹夹紧皮管底部，分离线虫时在分离筛底部垫一张纱布或滤纸。将栽培介质和土壤铺在纱布或滤 纸上，将筛置于漏斗上，加水至没过样本表面。24 h～48 h 后，用培养皿收集漏斗底部的水样，在显微 镜下检查，挑取线虫，按附录 E 规定的方法制成临时玻片。检查鉴定。 6.2 显微镜观察、拍照和测量 对雌虫、雄虫、二龄幼虫的整体形态、唇区形态、食道腺形态、尾部形态及雄虫交合刺等鉴定特征 进行显微观察、拍照。每张照片应加相应标尺。需测量记录的项目和参数主要有： a） 体长； b） 最大体宽； c） 口针长； d） 尾长； e） 体前端至食道与肠连接处的距离； f） 泄殖腔至精巢最前端距离； g） 排泄孔至头端的距离。 3 DB35/T 1559-2016 7 形态鉴定特征 7.1 形态特征 7.1.1 未成熟雌虫形态特征描述 虫体蠕虫形，有清晰的环纹；头部锥圆、光滑、连续，无唇盘，头架中等硬化；口针具有圆形、发 达的基部球，背食道腺开口位于基部球后，约 4 μm；食道前体部长柱形，中食道球发达、卵圆形、有 发达的瓣，峡部细长柱形，后食道腺囊状，略向腹面偏移且与肠交界清楚，有贲门瓣；排泄孔显著，紧 位于阴门前，其到头端距离是体长在 80.2（76.9～84.2）%，排泄管清楚；阴门位于虫体近后端部，阴 门唇厚，单卵巢、前伸、未发育成熟，有几个卵母细胞，无后阴子宫囊；直肠和肛门退化，尾端钝圆。 未成熟雌虫形态特征参见附录 A 7.1.2 成熟雌虫形态特征描述 成熟雌虫：虫体颈部呈不规则的弯曲，口针纤细，角质膜薄；虫体后部呈不规则明显膨大、最宽处 约 68 μm～100 μm 角质膜厚、无环纹，阴门以后的虫体呈指状并朝腹面弯曲，长为 36（32～43）μm； 排泄孔和阴门位于虫体后部，排泄孔位于阴门前 36（32～43） μm，距头端的距离是体长的 82.5（79.4～ 85.0）%；卵巢盘卷，受精囊有精子，子宫内有单个的卵；无直肠和肛门。 成熟雌虫形态特征参见附录 A 7.1.3 雄虫形态特征描述 虫体显蠕虫形，细小，热杀死后虫体前部直，尾部略弯，侧区不明显；头部光滑、锥圆，骨质化； 口针和食道退化，口针基部球小，中食道球弱、纺锥形，后食道腺溢缩；排泄孔位于虫体中后部；单精 巢、前伸，无交合伞，交合刺较细、弓状、长度为 14 μm～18 μm，引带长 3 μm～4 μm，尾长圆锥形、 端圆。 雄虫形态特征参见附录 A 7.1.4 二龄幼虫形态特征描述 虫体直或弯，侧区不清楚，刻线 2 条；头部、口针和食道特征似未成熟雌虫，背食道腺开口位于口 针基本球后，食道腺略覆盖肠；排泄孔位于体中后部；无直肠和肛门，尾长圆锥形、端尖到圆。 二龄幼虫的形态特征图见附录 A。 7.2 测计数据 柑橘半穿刺线虫测计数据（参考数值）见附录C 4 DB35/T 1559-2016 8 结果判定 以雌成虫、雄成虫、二龄幼虫为主要观测对象，将观察、测量获得的各鉴定特征作为检疫鉴定的依 据，形态特征符合本标准第 8 章形态鉴定特征和附录 C 虫体测计数据应判定为柑橘半穿刺线虫。其附 录 B 柑橘半穿刺线虫的相关资料、附录 D 半穿刺线虫属种类鉴定检索表等信息可供参考。 9 标本和样品保存与处理 9.1 保存方法 9.1.1 标本保存 将分离鉴定为柑橘半穿刺线虫按附录 E 的规定进行灭活、固定并制成永久玻片保存。标签上应注 明样品编号、寄主、产地、制作人和制作时间。 9.1.2 寄主样品保存 对已鉴定出带有柑橘半穿刺线虫的植物材料，应登记、保存，并做好标识，标明样品基本情况，如： 样品编号、截获人、截获日期、寄主名称、运输工具名称、产地等。 9.2 保存时间 含有柑橘半穿刺线虫的样品，保存至少 6 个月备用。 9.3 处理 保存期满后，含有柑橘半穿刺线虫的样品应作灭活处理。 5 DB35/T 1559-2016 附 录 A （资料性附录） 柑橘半穿刺线虫形态特征图 A.雄虫体前部；B,C.雄虫尾部；D,E.未成熟雌虫体后部和前部；F.2 龄幼虫体前部 G..在柑橘根部的雌虫；H. 成熟雌虫; I. 雄虫发育各阶段虫态；J. 雌虫发育各阶段虫态 图 A.1 柑橘半穿刺线虫主要形态特征图（A～G,I,J 仿 Siddiqi,1974;H 仿 Luc et al.,1990） 6 DB35/T 1559-2016 A. 寄生根部组织的雌虫；B. 成熟雌虫; C.雌虫尾部；D. 雄虫尾部； 图 A.2 柑橘半穿刺线虫主要形态扫描电镜照片 7 DB35/T 1559-2016 附 录 B （资料性附录） 柑橘半穿刺线虫相关资料 B.1 柑橘半穿刺线虫的主要寄主 柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans Cobb.)最早于1912年在美国加利福尼亚州的黄化柑橘植 株根部发现，目前在全世界柑橘产区广泛分布。该线虫是一种寄生专化性比较强的线虫，其主要寄主为 柑橘属及其杂种，如柠檬、葡萄柚、金桔、四季桔、柚、柑、橙、黄皮等。此外为害较为严重的植物还 有葡萄、柿、油橄榔。其他寄主还有枇杷、草莓、梨、桃、龙眼、荔枝、芒果、苹果、板栗、九里香、 日本鹿蹄、杉木。 柑橘半穿刺线虫不同种群存在不同的寄主选择，存在致病力分化，根据对柑橘(Citrus spp.)、