ICS 65.140.10 B 47 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1672—2017 蜜蜂微孢子虫病诊断方法 Protocol of diagnosis for Nosemosis of bees 2017 - 07 - 03 发布 福建省质量技术监督局 2017 - 10 - 03 实施 发 布 DB35/T 1672—2017 目 次 前言 .................................................................................................................................................................... II 1 范围 .............................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件 .......................................................................................................................................... 1 3 疾病概述 ...................................................................................................................................................... 1 4 设备、材料和试剂 ...................................................................................................................................... 1 5 临床诊断 ...................................................................................................................................................... 3 6 采样 .............................................................................................................................................................. 3 7 实验室诊断 .................................................................................................................................................. 3 8 综合判定 ...................................................................................................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试剂配制 ................................................................................................................ 6 附录 B（资料性附录） 微孢子虫图片 ........................................................................................................ 8 附录 C（资料性附录） 参考序列 .............................................................................................................. 10 附录 D（资料性附录） 核酸扩增电泳图 ...................................................................................................11 I DB35/T 1672—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、福建农林大学、吉林出入境检验检疫 局、北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张体银、郑腾、黄少康、白泉阳、宋战昀、王武军、张志灯、张伟、于师宇。 II DB35/T 1672—2017 蜜蜂微孢子虫病诊断方法 1 范围 本标准规定了蜜蜂微孢子虫病疫病概述、设备、材料和试剂、临床诊断、采样、实验室诊断和综合 判定。 本标准适用于蜜蜂微孢子虫病的诊断和蜜蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疾病概述 3.1 病原学 蜜蜂微孢子虫病又名蜜蜂微粒子病，是世界上养蜂国家重要的检疫性病害。目前发现并确认的蜜蜂 微孢子虫有2种，一种是蜜蜂微孢子虫（Nosema apis），另一种是东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）。 前 者 寄 生 西 方 蜜 蜂 A. mellifera， 后 者 寄 生 东 方 蜜 蜂 A cernan、 西 方 蜜 蜂 A. mellifera和 沙 巴 蜂 A. koschevnikovi。 3.2 流行病学 微孢子虫病是目前蜜蜂病害中最引人关注、研究最广的一种病，该病在世界范围内存在。水平传播 是蜜蜂微孢子虫病的的主要方式，孢子在蜂群中的传播主要通过粪便—口腔途径，蜜蜂个体间的食物交 换、蜜蜂个体取食受污染的食物、迷巢蜂和盗蜂均可引起该病在蜂群间的传播。微孢子虫病既能感染蜂 王，导致蜂王卵巢发育不良；也可感染工蜂成年蜂、幼虫和蛹，造成蜂群的营养不良、体质下降、寿命 缩短、产量下降等危害，不仅造成蜂群衰亡，使生产和繁殖均受影响，而且因授粉能力下降而带来的农 业损失难以估量。如果与其他蜜蜂病原共同感染，引发并发症，其损失更加严重。 4 设备、材料和试剂 4.1 设备 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 培养箱（37 ℃±1 ℃）。 高速冷冻离心机。 生物安全柜。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃）。 微量可调移液器。 1 DB35/T 1672—2017 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 梯度 PCR 仪。 电泳仪。 紫外凝胶成像系统。 光学显微镜。 4.2 材料和试剂 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 4.2.12 4.2.13 4.2.14 4.2.15 4.2.16 4.2.17 4.2.18 试验用水：应符合 GB/T 6682—2008 所规定的一级水要求。 浓盐酸。 无水乙醇。 无水乙醚。 TE 缓冲液。 0.01 mol/L 磷酸盐（PBS）缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.1。 10% SDS 溶液，配制方法见附录 A 中 A.2。 蛋白酶 K。 CTAB/NaCl 溶液，配制方法见附录 A 中 A.3。 酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录 A 中 A.4。 三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录 A 中 A.5。 2×High-Fidelity Master Mix。 0.5×TAE 电泳缓冲液。其中，TAE 电泳缓冲液配制方法见附录 A 中 A.6。 上样缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.7。 2.0%琼脂糖凝胶。 溴化乙锭（10 mg/mL），配制方法见附录 A 中 A.8。 DNA 相对分子质量标准物 Marker。 DNA 纯化回收试剂盒。 4.3 引物和质控物质 4.3.1 引物序列 4.3.1.1 蜜蜂微孢子虫引物序列 上游引物（N.apis-F）：5′- GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA - 3′； 下游引物（N.apis-R）：5′- GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG - 3′； 蜜蜂微孢子虫扩增产物322 bp。 4.3.1.2 东方蜜蜂微孢子虫引物序列 上游引物（N.ceranae-F）：5′- CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA - 3′； 下游引物（N.ceranae-R）：5′- CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG - 3′； 东方蜜蜂微孢子虫扩增产物219 bp。 4.3.1.3 引物的稀释和保存 引物用ddH2O溶解至20 μmol/L后，保存于-20 ℃备用，引物中标下划线的CG接头用来调整合适的 退火温度。 2 DB35/T 1672—2017 4.3.2 质控物质 4.3.2.1 4.3.2.2 4.3.2.3 4.3.2.4 阴性对照为未感染蜜蜂微孢子虫的健康蜜蜂。 蜜蜂微孢子虫阳性对照为感染蜜蜂微孢子虫的蜜蜂或含目的片段的 DNA。 东方蜜蜂微孢子虫阳性对照为感染东方蜜蜂微孢子虫的蜜蜂或含目的片段的 DNA。 空白对照用水代替样品。 5 临床诊断 5.1 临床症状 5.1.1 蜜蜂微孢子虫病感染前期，工蜂与健康工蜂没有差别，活动正常，感染后期肠道受损，消化功 能紊乱，吸收功能降低，体质下降，生理功能减弱。 5.1.2 患病蜂王出现新