ICS 67.060 B 22 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2598—2017 花生品种真实性与纯度鉴定 SSR 法 2017 - 11 - 22 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 12 - 22 实施 发 布 DB13/T 2598—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：杨鑫雷、刘立峰、崔顺立、郭丽果、陈焕英、穆国俊、李洪珍。 I DB13/T 2598—2017 花生品种真实性与纯度鉴定 SSR 法 1 范围 本标准规定了利用SSR标记对花生品种真实性与纯度进行鉴定的术语和定义、原理、试剂材料、操 作程序、数据分析和判定规则。 本标准适用于利用SSR法对花生品种真实性与纯度鉴定的试验过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2-1995 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4-1995 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种真实性 （Varietal Genuineness） 供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。 3.2 品种纯度 （Varietal Purity） 品种在特征特性方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表 示。 3.3 简单重复序列 SSR（Simple Sequence Repeat） 基因组中以几个核苷酸（一般为2个～6个）为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序 列，又称微卫星标记。 注：由于基本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性。 3.4 聚合酶链式反应 PCR（Polymerase Chain Reaction） 一种用于在体外扩增 DNA 序列的技术程序。 注：模板 DNA 经高温变性为单链，在 DNA 聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与 DNA 模板两条链上的一段互补 序列发生退火，并在 DNA 聚合酶的催化下以四种dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底 物，使退火引物延伸从而合成 DNA。如此变性退火和合成 DNA 反复循环，使位于两段已知序列之间的 DNA 片段呈几 何倍数扩增。 1 DB13/T 2598—2017 3.5 引物 Primer 结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH 末端作为DNA 合成的起点，延伸合成模板DNA 的互补 链。 3.6 核心引物 Core Primer SSR标记分析优先选用多态性高、稳定性好，识别能力强的一套引物的引物。 3.7 标准样品 Standard Sample 代表已知品种特征特性的育种家种子作为标准样品。 4 原理 花生基因组中存在着大量简单重复序列（SSR），由于SSR单元在不同基因型间重复次数不同，因 此同一位点的SSR在不同品种间往往具有丰富的长度多态性。利用PCR技术扩增每个位点的简单重复序 列，通过电泳分析其长度多态性，达到区别不同花生品种的目的。 5 试剂或材料 警示：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺具神经毒性，配制时应注意防护。 除非另有说明，使用分析纯试剂和重蒸馏水应符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三羟甲基氨基甲烷（Tris）：分子式为 C4H11NO3, CAS77-86-1。 5.2 氯化锂 (LiCl)：CAS7447-41-8。 5.3 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA·Na2）：分子式为 C10H16N2O8Na2·2H2O，CAS60-00-4。 5.4 十二烷基硫酸钠(SDS)：分子式为 C12H25NaO4S，CAS151-21-3。 5.5 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：分子式为(C6H9NO)41，CAS9003-39-8。 5.6 β -巯基乙醇：分子式为 C2H6OS，CAS60-24-2。 5.7 酸酚（acid phenol pH 4.3）。 5.8 异戊醇：分子式为 C5H12O，CAS123-51-3。 5.9 Tris 饱和酚（pH 8.0）。 5.10 三氯甲烷：分子式为 CHCl3，CAS67-66-3。 5.11 无水乙醇：分子式为 C2H6O，CAS64-17-5。 5.12 硫氰酸胍：分子式为 CH5N3·CHNS，CAS593-84-0。 5.13 二水柠檬酸钠：分子式为 C6H9Na3O9，CAS6132-04-3。 2 DB13/T 2598—2017 5.14 乙酸铵：分子式为 C2H7NO2，CAS631-61-8。 5.15 十二烷基肌氨酸钠：分子式为 C15H28NO3·Na，CAS137-16-6。 5.16 异丙醇：分子式为 C3H8O，CAS67-63-0。 5.17 氯化钠：分子式为 NaCl，CAS7647-14-5。 5.18 氢氧化钠：分子式为 NaOH，CAS1310-73-2。 5.19 Taq DNA 聚合酶：保存条件为-20℃±2℃ 。 5.20 四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为 dNTPs。 5.21 硼酸：分子式为 BH3O3，CAS11113-50-1。 5.22 丙三醇：分子式为 C3H8O3，CAS56-81-5。 5.23 溴酚蓝：分子式为 C19H10Br4O5S，CAS115-39-9。 5.24 二甲苯氰 FF：分子式为 C25H27N2NaO7S2，CAS4463-44-9。 5.25 丙烯酰胺：分子式为 C3H5NO，CAS79-06-1。 5.26 甲叉双丙烯酰胺：分子式为 C7H10N2O2，CAS110-26-9。 5.27 N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）：分子式为 C10H24N2，CAS150-77-6。 5.28 过硫酸铵：分子式为 H8N2O8S2，CAS7727-54-0。 5.29 冰醋酸：分子式为 C2H4O2，CAS64-19-7。 5.30 硫代硫酸钠：分子式为 Na2O3S2，CAS7772-98-7。 5.31 硝酸银：分子式为 AgNO3，CAS7761-88-8。 5.32 甲醛溶液：分子式为 CH2O，CAS50-00-0。 5.33 1 mol/L Tris-HCl 溶液 2 121.1 g Tris碱溶于适量水中，加HCl调pH至7.5，定容至1L，1.05 kg/cm 高压蒸汽灭菌15 min， 4℃贮存。 5.34 4 mol/L LiCl 溶液 称取84.78 g LiCl置于烧杯中，加入500 mL去离子水，搅拌溶解，室温保存。 5.35 15%(w/v) SDS 溶液 称取15 g SDS至于烧杯中，加入800 mL的去离子水。68℃加热溶解，加浓盐酸调节pH值至7.5，定 容至100 mL,室温保存。 5.36 0.5 mol/L EDTA 溶液 称取187.61 g EDTA-Na2·2H2O溶于800 mL去离子水中，用固体NaOH调pH值至7.5，定容至1L，1.05 2 kg/cm 高压蒸汽灭菌15 min，4℃贮存。 3 DB13/T 2598—2017 5.37 溶液Ⅰ 称取20 g PVP溶于500 mL去离子水中，然后加入100 mL 1 mol/L Tris-HCl，100 mL 0.5 mol/L EDTA， 100 mL 15 % SDS，37.5 mL LiCl，15 mL β -巯基乙醇（用时现加），定容至1 L，4℃贮存。 5.38 氯仿：异戊醇 体积比为 24：1。 5.39 酚：氯仿：异戊醇 体积比为 25：24：1。 5.40 溶液Ⅱ 称取236.32 g 硫氰酸胍, 147.05 g 二水柠檬酸钠, 115.62 g 乙酸铵, 10 g 十二烷基肌氨酸钠溶 于800 mL去离子水中, 加乙酸调节pH值至5.2 ，定容至1L，4℃贮存。 5.41 1.2 mol/L NaCl 溶液 称取35.06 gNaCl溶于500 mL离子水中，室温贮存。 5.42 70%无水乙醇溶液 5.43 加样缓冲液 称取 EDTA0.88g、溴酚兰0.05 g、二甲苯氰FF0.05 g于烧杯中，然后加入40 mL去离子水，加热搅 拌至充分溶解，再加入36 mL丙三醇，加2 mol/L NaOH调pH值至7.0，定容至100 mL，4℃贮存。 5.44 30%非变性聚丙烯酰胺溶液 称取290 g丙烯酰胺、410 g甲叉双丙烯酰胺于烧杯中，然后加入600 mL去离子水，室温充分溶解, 加去离子水定溶至1 L，过滤，4℃贮存。 5.45 10%过硫酸铵溶液 10 %（g/mL）过硫酸铵。4℃贮存。 5.46 10×Tris/硼酸电泳缓冲液（10×TBE） 2 称取108 g Tris、7.44g Na2EDTA/硼酸55 g至于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L。1.05 kg/cm 高压蒸汽灭菌15 min，4℃贮存。 5.47 1% 硫代硫酸钠 1 %（g/mL）硫代硫酸钠。室温贮存。 5.48 固定液 其中含10 %（体积比）无水乙醇和0.5 %（体积比）冰乙酸，既用即配。 5.49 染色液 0.2 %（g/mL）AgNO3，即用即配。 5.50 显影液 其中含1.5 %（g/ml）NaOH和0.4 %（体积比）甲醛，即用即配。 4 DB13/T 2598—2017 6 仪器设备 6.1 PCR 扩增仪：96 孔，0.2 mL。 6.2 高速冷冻离心机：最大离心力≥12,000 g。 6.3 电泳检测系统：垂直电泳系统。 6.4 微量移液器：规格分别为 2 μ L、10 μ L、20 μ L、100 μ L、200 μ L、1000 μ L，连续可调。 6.5 低温冰箱：最低温度-20 ℃。 6.6 高压灭菌锅：120℃±2 ℃。 6.7 电子天平：精确度 0.001 g。 6.8 恒温水浴锅：温控精确度±1 ℃。 6.9 脱色摇床：圆周振荡。 6.10 磁力搅拌器。 6.11 微波炉。 6.12 胶片观察灯。 6.13 酸度计：精度±0.01 pH。 6.14 垂直振荡仪。 6.15 紫外分光光度计（230 nm、260 nm、280 nm）。 7 样品 受检样品种子重量为1000 g，随机选取大小均一、健康饱满的种子100粒，重复3次，按GB/T 3543.4-1995进行发芽试验，其余种子置于塑封袋中常温或4