ICS 65.020 B 05 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2827—2017 分蘖洋葱脱毒试管苗繁育技术规程 Code of practice for in vitro virus-free seed tillered-onion breeding 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2827—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省蔬菜花卉科学研究院。 本标准主要起草人：王秀峰、王学国、张悦、王健鹂、聂楚楚、马艺荞、于永辉、张爽爽。 I DB22/T 2827—2017 分蘖洋葱脱毒试管苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了分蘖洋葱脱毒试管苗繁育的茎尖脱毒与培养、试管苗病毒检测、核心试管球培养、基 础苗培养、试种观察、基础苗结球、扩繁及壮苗的技术要求和操作规程。 本标准适用于分蘖洋葱脱毒试管苗的培育和扩繁。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 29375-2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 GB/T 29375-2012界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用以下重复列出了GB/T 29375-2012中的某些术语和定义。 3.1 叶原基 leaf primordium 茎尖生长点基部形成的突起。 [GB/T 29375-2012,定义3.1] 3.2 茎尖 stem tip 茎的顶端分生组织及其周缘部分。 3.3 茎尖分生组织 meristem 茎顶端部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。 [GB/T 29375-2012,定义3.3] 3.4 鳞茎盘 bulb disc 鳞茎为地下变态茎的一种。变态茎短缩，呈盘状，其上着生肥厚多肉的鳞叶，其下着生根系。内贮 藏极为丰富的营养物质和水分。 3.5 离体培养 isolated culture 从生物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进 行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 [GB/T 29375-2012,定义3.4] 1 DB22/T 2827—2017 3.6 洋葱黄矮病 onion yellow dwarf 植物疾病，洋葱染病叶生长受抑，叶片扭曲变细，致叶面凹凸不平，叶尖逐渐黄化，有时产出长短 不一的黄绿色斑驳或黄色长条斑。葱管扭曲，生长停滞，蜡质减少，叶下垂变黄，严重的全株矮化或萎 缩。 3.7 洋葱黄矮病病毒 onion yellow dwarf virus 洋葱黄矮病的病原。 3.8 脱毒苗 in vitro virus-free plantlet 经检测确认不含有洋葱黄矮病毒的试管苗。 3.9 核心苗 core plantlet 通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒的种苗。 3.10 核心种球 core seed 核心苗经过结球诱导后，在试管内形成的种球。 3.11 基础苗 basic plantlet 由核心苗繁殖经检测无病毒的种苗。 3.12 基础种球 basic seed 基础苗经过结球诱导后，在试管内形成的种球。 4 茎尖脱毒与培养 4.1 脱毒材料的选取 4.1.1 田间选择 4.1.1.1 在结球期选择生长势强、具备原品种典型性状的健康植株，做好标记。 4.1.1.2 在生育后期到收获期，对标记的植株中进行复选。选择无病斑、无虫蛀、无机械损伤而且皮 色、形状等性状符合品种特征的分蘖洋葱完整种球，清洗后催芽作为脱毒材料。 4.1.2 病毒检测筛选 入选的植株，首先对其进行病毒检测，采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法 （DAS-ELISA） 按 NY/T 401-2000 中附录 A 的方法执行。若检测到没有携带洋葱黄矮病病毒的植株，可直接剥取较大的 茎尖，进行培养。 4.2 茎尖培养 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 2 茎尖培养基的制备 茎尖培养基配方见附录 A 。 将制备好的茎尖培养基快速分装于透光培养瓶中，用封口膜封口。 DB22/T 2827—2017 4.2.1.3 4.2.2 将盛有培养基的培养瓶于 121 ℃ 高压灭菌 20 min，自然冷却后备用。 材料消毒 取分蘖洋葱鳞茎盘清洗干净，沥干水分，在洁净环境条件下， 75% 乙醇浸泡 30 s 后，用 1% 的 次氯酸钠浸泡 7 min～10 min ，无菌水冲洗 4 次～5 次。 4.2.3 茎尖分生组织剥离、接种与培养 4.2.3.1 在超净工作台上剥去外层鳞片，借助 40×双目体视镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长点， 用无菌解剖刀或解剖针取生长点顶部 0.1 mm～0.3 mm，迅速接种于茎尖培养基（配方见附录 A）上， 封口并注明编号、品种名称和接种时间。 4.2.3.2 待生长点明显转绿，形成可见的叶鞘时，转移到结球培养基(配方见附录 B)上进行培养，生 长至 1～2 片叶鞘。 4.2.4 培养条件 茎尖培养温度 20 ℃～25 ℃、相对湿度 70%、光照强度 2000 lux～3000 lux，每天 16 h光照 8 h 黑暗交替培养。 5 试管苗病毒检测 在超净工作台内，按试管苗的编号取每株的上部 1/3～l/2 叶鞘作为样本，应按 NY/T 401-2000 中 附录A的方法，采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法（DAS-ELISA）对洋葱黄矮病毒进行检测，不含洋葱 黄矮病毒的脱毒苗即为核心苗。 6 6.1 6.2 7 核心试管球培养 将核心苗迅速转入结球培养基（配方见附录 B），封口并注明编号、品种名称和接种时间。 培养条件:同 4.2.4，培养 42 d～45 d，核心苗在培养器皿中膨大结球，获得核心种球。 基础苗培养 7.1 在超净工作台上切取核心种球鳞茎盘及其上部 2 mm 左右的鳞片，去除中心生长点，沿主生长点 纵向平均分割成 4 份。 7.2 将切割的鳞茎盘按自然生长方向插入增殖培养基(配方见附录 C)，封口并注明编号、品种名称和 接种时间。 7.3 培养条件:同 4.2.4。 7.4 分株培养：经过 25 d～28 d 的培养，鳞茎盘分化出丛生苗，将丛生苗在鳞茎盘底端分割，形成 单株的基础苗。 8 试种观察 按照 1%～2% 的比例抽取来源于同一核心种球的基础苗移栽到防虫网棚进行田间种植，检验其是否 发生性状变异。选择性保持种性的基础苗进行结球培养。 3 DB22/T 2827—2017 9 基础苗结球 9.1 在超净台上将入选的基础苗转入结球培养基（配方参附录 B），封口并注明编号、品种名称和接 种时间。 9.2 培养条件:同 4.2.4，培养 42 d～45 d，基础苗在试管内膨大结球，获得基础种球。 10 扩繁 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 10.8 扩繁前检测基础种球是否带洋葱黄矮病毒，方法见 5。 选择扩繁培养基：配方见附录 C。 增殖培养基配制：同 4.2.1.3。 种球分割：将检测合格的基础种球按 7.1 进行分割。 接种：同 7.2。 培养条件：同 4.2.4。培养时间 25 d～28 d，形成丛生苗。 分株培养：将丛生苗在鳞茎盘底端分割，形成单株分蘖洋葱脱毒苗。 结球培养：再次移入结球培养基(配方见附录 B)诱导结球，42 d～45 d 后可再次扩繁。 11 壮苗培养 11.1 壮苗培养：将最后一次扩繁的脱毒苗接种到壮苗培养基(配方见附录 D)上培养。 11.2 培养条件：置于温度 22℃～25 ℃，光照 2000 lux～3000 lux， 18 h 光照 6 h 黑暗交替培养， 培养株高至 6 cm～7 cm 准备定植。 4 DB22/T 2827—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 茎尖培养基配方 茎尖培养基配方见表A.1。 表A.1 茎尖培养基配方 单位：mg 大量元素（母液Ⅰ） 称取量 称取量 母液 500ml 母液 1000ml NH4NO3 16500 33000 KNO3 19000 38000 MgSO4.7H2O 3700 7400 KH2PO4 1700 3400 CaCL2.2H2O 4400 8800 成份 扩大倍数 配 1L 吸取量 ml 20× 50 200× 5 200× 5 200× 5 100× 10 微量元素（母液Ⅱ） ZnSO4.7H2O 860 1720 H3BO3 620 1240 KI 83 166 NaMoO4.2H2O 25 50 CuSO4.5H2O 2.5 5 CoCL2.6H2O 2.5 5 铁盐（母液Ⅲ） Na.EDTA.2H2O 3725 7450 FeSO4.7H2O 2785 5570 有机物（母液Ⅳ） 甘氨酸 100 200 盐酸硫胺素（B1） 20 40 盐酸吡哆醇素（B6） 25 50 烟酸 25 50 肌醇（单配） 肌醇 5000 10000 激素 萘乙酸（NAA） 500 1000 异戊烯腺嘌呤（2-ip） 500 1000 1000× 0.1 0.4 其他 糖 30 g/L 琼脂 6 g/L 5 DB22/T 2827—2017 BB 附 录 B （规范性附录） 结球培养基 结球培养基见表B.1。 表B.1 结球培养基 单位：mg 大量元素（母液Ⅰ） 称取量 称取量 母液 500ml 母液 1000ml NH4NO3 16500 33000 KNO3 19000 38000 MgSO4.7H2O 3700 7400 KH2PO4 1700 3400 CaCL2.2H2O 4400 8800 成份 扩大倍数 配 1L 吸取量 ml 20× 50 200× 5 200× 5 200× 5 100× 10 微量元素（母液Ⅱ） ZnSO4.7H2O 860 1720 H3BO3 620 1240 KI 83 166 NaMoO4.2H2O 25 50 CuSO4.5H2O 2.5 5 CoCL2.6H2O