ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3087—2019 猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别 qPCR 法 Identification of classical and variant strains of porcine epidemic diarrhea virus Real-time PCR method 2019 - 12 - 25 发布 吉林省市场监督管理厅 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB22/T 3087—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学。 本标准主要起草人：张双、王开、郭衍冰、裴志花、黄海龙、朱俊辉、李响、胡桂学。 I DB22/T 3087—2019 猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别 qPCR 方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株 qPCR 法技术的要求。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 36871 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 qPCR: 实时荧光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction) RNA：核糖核酸 (ribonucleic acid) cDNA: 互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid) Rnase：核糖核酸酶 (ribonuclease) Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 在普通聚合酶链反应的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记 一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统 可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步。 5 试验条件 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应符合GB 19489的规定。 5.2 防污染措施 1 DB22/T 3087—2019 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂和材料 6.1 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 6.1.1 RNA 提取试剂盒。 6.1.2 反转录试剂盒。 6.1.3 Rnase free water。 6.1.4 ROX Reference DyeⅡ。 6.1.5 qPCR Probe Master Mix。 6.1.6 阳性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株 CV777（GenBank：AF353555.1）和变异毒株 HB-2012-1 （GenBank：JX435302.1）的 cDNA 或含目的片段的阳性质粒。 6.1.7 阴性对照，Rnase free water。 6.2 耗材 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.3 无 RNase 离心管，0.2 mL，1.5 mL。 无 RNase 吸头，10 μL。 吸头，10 μL，200 μL，1 000 μL。 qPCR 反应管，根据 qPCR 仪选配。 引物和探针 表1 qPCR 的引物序列和浓度 序列 浓度 扩增片段大小 5’―3’ pmol/µL bp 上游引物 F AYTTTAGGCGGTTCTTTTC 20 下游引物 R ARATACCATGAACGCCACT 20 探针 C HEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA 10 探针 V FAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA 10 引物和探针名称 7 仪器 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 8 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 可调移液器，最大量程为 10 μL，200 μL，1 000 μL。 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 ℃。 冰箱，-20 ℃。 多通道荧光定量 qPCR 扩增仪。 样品 样品的采集和处理应符合 GB/T 36871 的规定。 2 135 DB22/T 3087—2019 9 操作步骤 9.1 RNA 提取和反转录 使用 RNA 提取试剂盒（6.1.1）提取样品 RNA 后，按照反转录试剂盒(6.1.2)说明书要求制备cDNA。 以提取的 cDNA为模板进行 qPCR 扩增，或置于-20 ℃冰箱保存(7.4)，一周内使用。 9.2 反应体系 9.2.1 qPCR 扩增反应体系见表 2。 表2 qPCR 反应体系 试剂 剂量 Rnase free water 7.1 μL 模板 1.0 μL 上游引物 F 0.5 μL 下游引物 R 0.5 μL 探针 C 0.3 μL 探针 V 0.3 μL ROX Reference DyeⅡ 0.3 µL qPCR Probe Master Mix 10.0 μL 总体积 20.0 μL 9.2.2 以 Rnase free water(6.1.3)为阴性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株 CV777（GenBank： AF353555.1）和变异毒株 HB-2012-1（GenBank：JX435302.1）的 cDNA 或含目的片段的阳性质粒为阳 性对照。 9.3 反应程序 qPCR 反应程序见表3。 表3 qPCR 反应程序 反应步骤 温度/℃ 时间 循环数次 第一步 50 5 min 1 95 10 min 60 35 s 第二步 40 10 结果判定 10.1 结果分析条件设定 试验结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光信号 达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高 点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。 10.2 质控标准 3 DB22/T 3087—2019 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct 值应＜30，并出现特定的扩增曲线。 10.2.3 如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，实验结果视为无效。 10.3 结果描述及判定 10.3.1 无 Ct 值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为阴性。 10.3.2 HEX 荧光信号 Ct 值＜35，出现典型的扩增曲线参见附录 A.1，判为猪流行性腹泻病毒经典毒株 阳性。FAM 荧光信号 Ct 值＜35，出现典型的扩增曲线参见附录 A.2，判为猪流行性腹泻病毒变异毒株阳 性。同时出现以上两种曲线参见附录 A.3，判为猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株均为阳性。 10.3.3 35≤Ct＜37，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑似，判定为 阳性。 4 DB22/T 3087—2019 A 附 录 A （资料性附录） qPCR 扩增图 变异毒株参考扩增图见图A.1。 图A.1 变异毒株扩增 图A.2 经典毒株扩增 经典毒株参考扩增图见图A.2。 经典与变异毒株参考扩增图见图A.3。 5 DB22/T 3087—2019 图A.3 同时扩增经典与变异毒株 ———————————————————————— 6