11.220 ICS B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3256—2020 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 Loop-mediated Isothermal Amplification（LAMP）for Rapid Detection for African Swine Fever Virus 2020 - 04 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2020 - 05 - 30 实施 发 布 DB21/ XXXXX—XXXX 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中国科学院微生物研究所、洛阳莱普生信息科技有限 公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。 本标准主要起草人：杨作丰、周晨阳、李秀梅、王宏燕、杨利敏、董娜、刘文军、张皓淳、姚伟、 刘洋、刘近、吴洪涛、任雪建、赵培、李蓉、章春燕、吕园园、陈腾。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址： 辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862； 标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电 话：024-24229579。 I DB21/T 3256—2020 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。 本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等 组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 原理 非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，该检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在 等温环境下1 h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。 4 仪器和器材 4.1 高速台式冷冻离心机（离心范围 0～20000 r/min） 4.2 冰箱：4 ℃±1 ℃冰箱，-20 ℃±1 ℃冰箱，-7 ℃±1 ℃冰箱 4.3 恒温 LAMP 扩增仪（型号：Gene-8C） 4.4 离心管：15 ml 离心管、1.5 ml 离心管和 0.2 ml PCR 专用离心管 4.5 微量移液器：1000 μl，200 μl，100 μl，50 μl，20 μl，10 μl，2 μl 5 试剂和引物 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 样品处理剂 ASFV-R-Mix Bst enzyme D-I 矿物油 阳性对照 阴性对照 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂； 所有试剂均用无菌的容器分装。 1 DB21/T 3256—2020 6 操作步骤 6.1 样品的采集、前处理、存放与运输 6.1.1 采样注意事项 采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 6.1.2 采样工具 15 ml离心管和1.5 ml离心管经121±1 ℃高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 ℃干热灭菌2 h，无 菌管（真空采血管）。 6.1.3 组织病料的采集与前处理 采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待 检样品约10 g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3 ml～0.5 ml组织悬液混匀，60 ℃，30 min 灭活后，将悬液转入无菌Eppendorf管中，4 ℃条件下5000 r/min离心10 min，编号备用。 6.1.4 全血及血清样本的采集与前处理 使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液3 ml～5 ml，60 ℃，30 min灭活后，可直接检测；若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无 菌Eppendorf管中，60 ℃，30 min灭活后，编号备用。 6.1.5 存放与运输 采集或处理的样品在2～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱，但应 避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在8 h之内运送 到实验室检测。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 6.2 样品 DNA 的提取 取10 μl前处理过的样本加入无菌1.5 ml离心管，加入10 μl样品处理剂，混匀，94 ℃裂解2 min， 瞬时离心，上清即为扩增模板。 6.3 核酸扩增 6.3.1 吸取 22 μl ASFV-R-Mix 和 1 μl Bst enzyme 加入同一个 PCR 管，吸取 2 μl 步骤 6.2 处理的 核酸扩增模板加至 PCR 管，混匀，设置阴阳性对照； 6.3.2 吸取 10 μl D-I 矿物油轻轻加至 PCR 管液面，切勿震荡混匀； 6.3.3 插入到恒温扩增仪反应槽中； 6.3.4 设置恒温扩增仪器反应条件为：65 ℃反应 12 min，荧光采集周期 20 s。 7 试验成立条件与结果判定 7.1 试验成立条件 使用前用阴、阳性对照进行该检测方法评价，若阳性对照CT值≤40，阴性对照CT值＞40，则检测结 果有效。 2 DB21/T 3256—2020 7.2 结果判定 若CT值≤40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若CT值＞40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸 阴性 8 实验室生物安全要求 按照GB19489 实验室生物安全通用要求执行。 3 DB21/T 3256—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 样品处理剂的制备 量取80 ml PBS（0.01 mol/L，pH值7.4），加入10 μl NP40（乙基苯基聚乙二醇），无菌纯化水 定容至100 ml，定量分装，500 μl/管，-20 ℃保存。 A.2 ASFV-R-Mix的制备 A.2.1 引物合成 根据非洲猪瘟病毒p72基因片段的保守结构域设计3对引物，包括1对内引物（FIP与BIP）、1对外引 物（F3与B3）和1对环引物（LF与LB），均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为： FIP： 5'-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3' BIP： 5'-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3' F3： 5'-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3' B3： 5'-CCAACAATAACCGCCACGC-3' LF： 5'-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3' LB： 5'-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3' A.2.2 引物混合物的制备 取3对引物（FIP、BIP、F3、B3、LF和LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混 匀，得到各引物溶液，置-20 ℃保存。 A.2.3 ASFV-R-Mix的配制 称取2.4 g Tris，0.37 g氯化钾，0.12 g硫酸镁，100 μl吐温-20，7.029 g甜菜碱，溶于80 ml 纯化水，依次加入终浓度为1.4 mmol/L dNTPs溶液、0.2 μmol/L外引物溶液、1.6 μmol/L内引物溶液、 0.8 μmol/L环引物溶液，加入无菌纯化水定容至100 ml，经过0.22 μm滤器过滤除菌，分装至2 ml蓝 盖可立冻存管中，1.1 ml/管，-20 ℃保存。 A.3 Bst enzyme的制备 6 用于制备本试剂盒的Bst enzyme为商品化DNA聚合酶，按使用说明书用纯化水稀释至4×10 /L，分 装至0. 5ml白盖可立冻存管中，100/μl管，-20 ℃保存。 A.4 D-I矿物油 用于制备本试剂盒的D-I矿物油为商品化矿物油，分装至2 ml黄盖可立冻存管中，500 μl/管， -20 ℃保存。 A.5 阳性对照 3 采用核酸蛋白质分析仪测定阳性质控品浓度，计算质粒拷贝数，用纯化水将其稀释为10 拷贝/μl， 分装至0.5 ml红盖可立冻存管中，100 μl/管，-20 ℃保存。 A.6 阴性对照 取纯化水，分装至0.5 ml绿盖可立冻存管中，100 μl/管，-20 ℃保存。 4 DB21/T 3256—2020 _________________________________ 5