ICS 65.020.30 CCS B41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2503—2022 捕食线虫性真菌捕食活性评价技术规范 Specification for predatory activity of nematode-trapping fungi 2022-01-25 发布 2022-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2503—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、兴安盟科尔沁右翼前旗农牧业科 学技术发展中心、中华人民共和国呼和浩特海关、通辽市科尔沁左翼中旗畜牧工作站、内蒙古自治区动 物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：李军燕、罗晓平、王瑞、杨晓野、凤英、乔蕾、邵国玉、陈林军、王文蕊、樊 凤娇、高娃、耿万恒、陈伟、刘阳、王鹏龙。 I DB15/T 2503—2022 捕食线虫性真菌捕食活性评价技术规范 1 范围 本文件规定了捕食线虫性真菌捕食活性的评价方法及指标。 本文件适用于捕食线虫性真菌捕食活性的评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 捕食线虫性真菌 nematode trapping fungi 能够产生捕食性器官，将线虫幼虫捕获致死的一类杀线虫性真菌。 捕食性器官 trapping fungus 由捕食线虫性真菌菌丝营养细胞自发或在一定条件刺激下特化产生的一个或多个细胞，简称捕食 器。 胃肠道线虫 gastrointestinal nematode 能够寄生在动物胃肠道内的线虫。 目标虫体 target parasite 为评价捕食线虫性真菌杀线虫活性而使用的虫体。本文件确定使用捻转血矛线虫三期幼虫（捻转血 矛线虫L3）。 捕食率 trapping rate 1 DB15/T 2503—2022 被捕食线虫性真菌捕获的目标虫体占目标虫体总量的百分率。 4 目标虫体及捕食线虫性真菌培养 捻转血矛线虫三期幼虫培养与收集 取感染有捻转血矛线虫的羊只粪便样本，于28 ℃条件下培养，收集感染性幼虫，实验用水应符合 GB/T 6682的相关规定。详细步骤见附录A。 捻转血矛线虫三期幼虫的无菌处理 将收集的捻转血矛线虫L3用无菌蒸馏水、抗生素等反复洗涤，以达到无菌效果，实验用水应符合 GB/T 6682的相关规定。详细步骤见附录A。 有孔玉米粉琼脂培养基的制备 取商品化的玉米粉琼脂培养基，经高压后制备有孔固体培养基，实验用水应符合GB/T 6682的相关 规定。详细步骤见附录B。 捕食线虫性真菌的培养 取待检捕食线虫性真菌，置于有孔玉米粉琼脂培养基中进行培养。详细步骤见附录B。 5 捕食线虫性真菌捕食活性评价方法 操作步骤 在显微镜下观察有孔玉米粉琼脂培养基上捕食线虫性真菌的生长情况，待其5个孔完全被菌丝覆盖 后，取出培养皿，在生物安全柜中加入按4.2处理且活力正常、30 d内收集的捻转血矛线虫L3，每孔加 入约50条。自加入虫体6 d后，于显微镜下观察并统计捕食率，捕食率以5个培养孔的平均捕食率计算。 捕食率统计 目标虫体被捕食线虫性真菌的捕食器捕获无法挣脱为捕食成功。捕食率计算公式如下： A= X/（X+Y）×100 %............................... （1） 式中： A——表示捕食率； X——表示被捕获的虫体数； Y——表示自由活动的虫体数。 6 捕食线虫性真菌捕食活性评价指标 捕食线虫活性评价标准 以捕食线虫性真菌捕食率的高低评价其捕食活性的强弱。 捕食线虫活性强 2 DB15/T 2503—2022 捕食线虫性真菌对目标虫体的捕食率大于70 %。 捕食线虫活性中等 捕食线虫性真菌对目标虫体的捕食率大于50 %且不大于70 %。 捕食线虫活性弱 捕食线虫性真菌对目标虫体的捕食率不大于50 %。 3 DB15/T 2503—2022 A A 附 录 A （规范性） 捻转血矛线虫三期幼虫培养、收集与无菌化处理 A.1 实验动物 感染有捻转血矛线虫的羊只，无其他胃肠道线虫感染。 A.2 仪器与试剂 A.2.1 仪器设备 生化培养箱（温度范围：0 ℃～60 ℃；温度波动度：±0.5 ℃）、离心机（15 mL水平转子；4000 rpm）、高压蒸汽灭菌锅（最高温度:135 ℃；最高压力：0.24 MP）。 A.2.2 试剂耗材 甲醛、青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素、水溶性两性霉素B、医用纱布、镊子（14 cm）、蒸 馏水喷壶、烧杯、一次性吸管、移液器、吸头、细胞培养瓶、15 mL离心管、一次性收粪袋（材质：40 目-100目尼龙网）、搪瓷盘（16 cm×24 cm×5 cm）。 A.2.3 耗材的无菌化处理 将所需耗材置于高压蒸汽灭菌锅内，经121 ℃，25 min灭菌后室温保存。 A.3 捻转血矛线虫三期幼虫的培养 取感染有捻转血矛线虫的羊只新鲜粪便，置于干净的搪瓷盘中，顶部稍高于搪瓷盘边缘，其上盖两 层医用纱布，盖好搪瓷盘盖，置于28 ℃恒温箱中。每日定时搅拌疏松粪便，并喷洒蒸馏水使粪便保持 湿度。 A.4 捻转血矛线虫三期幼虫的收集 培养7 d后，用灭菌蒸馏水将盖上的捻转血矛线虫L3冲洗到无菌烧杯中，自然沉淀后弃去上清，用 无菌蒸馏水调整浓度为1000 条/ml，置于细胞培养瓶中，液面高度约0.5 cm，10 ℃保存备用。 A.5 捻转血矛线虫三期幼虫的无菌化处理 将收集的捻转血矛线虫L3用无菌水4000 r/min离心5 min，重复洗涤3次。最后一次离心后弃掉上 清，将沉淀加入0.5 %的甲醛中浸泡15 min，然后再用无菌水4000 r/min离心5 min，重复洗涤3次。然 后加入青霉素200 U/mL、链霉素200 U/mL、卡那霉素100 μg/mL，制霉菌素12.5 μg/mL和两性霉素B5.0 μg/mL过夜，最后再用无菌水4000 r/min离心5 min，重复洗涤3次，可达到无菌效果。 4 DB15/T 2503—2022 B B 附 录 B （规范性） 培养基制备及捕食线虫性真菌的培养 B.1 仪器与试剂 B.1.1 仪器设备 生物安全柜（II级）、高压蒸汽灭菌锅（最高温度:135 ℃；最高压力：0.24 MP）、天平（量程： 500g；精度：0.01 g）、生化培养箱（温度范围：0 ℃～60 ℃；温度波动度：±0.5 ℃）。 B.1.2 试剂耗材 玉米粉琼脂培养基、三角瓶、称量纸、称量勺、无菌蒸馏水、锥形瓶、90 mm 无菌培养皿、打孔器、 无菌手术刀、酒精灯。 B.2 培养方法 B.2.1 有孔玉米粉琼脂培养基的制备 取商品化的玉米粉琼脂培养基，经121 ℃ 25 min高压灭菌。冷却至室温后，倒入直径为90 mm无菌 培养皿中。待培养基凝固后，用直径为10 mm的打孔器在培养基边缘15 mm的位置打5个孔，随后在酒精 灯下加热使培养基底部融化，在孔底部形成约1 mm厚度的薄膜，便于显微镜观察和拍照。 B.2.2 捕食线虫性真菌的培养 取保存于玉米粉琼脂培养基上的待检捕食线虫性真菌，于生物安全柜中，在菌丝生长均匀处用无菌 手术刀切下直径约为5 mm左右的琼脂块，倒置放在有孔玉米粉琼脂培养基的中间，置28 ℃恒温培养箱 中培养。 5 DB15/T 2503—2022 C C 附 录 C （资料性） 被捕食线虫性真菌捕获的捻转血矛线虫三期幼虫 被捕食线虫性真菌捕获的捻转血矛线虫三期幼虫（100x）见图C.1。 图C.1 被捕食线虫性真菌捕获的捻转血矛线虫三期幼虫（100x） 6